mezoterapia głogów cd

Ścieżki 6, 7 i 8 pokazują białka przekształcone ze wzorców segmentu 2 genu (egzony od 10b do 21). Wzór na ścieżkach 6 i 8 jest typowy dla normalnych komórek. Normalne polipeptydy pełnej długości zaznaczono strzałkami. Próbki w ścieżkach 1, 2, 4 i 7 (odpowiednio od Pacjentów 11, 9, 4 i 10) zawierają skrócone białka, oznaczone gwiazdkami. Próbki w ścieżkach 1, 2 i 4 wykazują utratę heterozygotyczności za pomocą polimorficznej analizy polimorfizmu szpiku białaczkowego w reakcji PCR. Całkowity brak prawidłowych prążków białka w próbce na ścieżce 4 jest zgodny z utratą normalnego allelu NF1 w tej linii komórkowej transformowanej EBV. Jest to jedyny przypadek, w którym wykazaliśmy udział komórek limfoidalnych w złośliwym klonie.22 Całkowity komórkowy RNA wyekstrahowano z komórek jednojądrzastych szpiku kostnego lub transformowanych EBV komórek limfoblastoidalnych za pomocą jednoetapowej metody izolacji RNA z użyciem jednofazowego roztworu fenolu i izotiocyjanianu guanidyny (odczynnik Trizol, GIBCO BRL). Zastosowaliśmy ogólne warunki doświadczalne i primery oligonukleotydowe, jak opisano w innym miejscu w teście IVTT.28 Analiza IVTT wykrywa mutacje nonsensowne lub przesunięcia ramki poprzez transkrypcję amplifikowanego, komplementarnego DNA (cDNA) do mRNA i translację mRNA do białka w jednej reakcji (Figura 1A) . Mutacje skracające są reprezentowane przez znakowane radioaktywnie peptydy, które są mniejsze niż pochodzące z prawidłowego produktu genowego na elektroforezie żelowej. C-RNA pierwszej nici syntetyzowano z całkowitego komórkowego RNA przy użyciu losowych heksamerów. Przeprowadzono amplifikację odwrotnej transkryptazy-reakcji łańcuchowej polimerazy (RT-PCR) w dwóch powtórzeniach z pięcioma parami starterów oligonukleotydowych, które amplifikują całą sekwencję kodującą białko NF1 (egzony do 49) w pięciu zachodzących na siebie segmentach o wielkości około 2 kb. 28 Starter przedni zawierał sekwencję promotora polimerazy RNA T7, jak również miejsce inicjacji translacji. Próbkę 2 .l produktu PCR i 10 .C znakowanej 35S metioniny dodano do sprzężonego systemu translacji translacji zawierającego lizat retikulocytów królika (Promega) i inkubowano w 30 ° C przez jedną godzinę. Otrzymane peptydy rozdzielono przez elektroforezę na 12,5% dodecylosiarczan sodowo-poliakryloamidowy i wizualizowano metodą autoradiografii.
Produkty RT-PCR, które dały początek skróconym białkom klonowano przy użyciu systemu wektorowego CloneAmp (GIBCO BRL), jak opisano w innym miejscu. 33. Plazmidowe DNA ekstrahowano z indywidualnych transformowanych kolonii po całonocnej hodowli i stosowano jako matrycę do drugiej rundy. IVTT. Uznawano, że polipeptydy IVTT pochodzące z plazmidu wędrują z normalnym lub skróconym białkiem za pomocą elektroforezy żelowej i tylko sekwencje cDNA przygotowane z kolonii dających skrócone białko zostały zsekwencjonowane.34 Bezpośrednie sekwencjonowanie klonowanego cDNA przeprowadzono za pomocą metod automatycznych z użyciem albo terminatory dideoksy znakowane fluoresceiną (Applied Biosystems) lub Seąuenase, wersja 2.0 (US Biochemical). Mutacje zostały potwierdzone w genomowym DNA pochodzącym z komórek białaczkowych przez amplifikację odpowiedniego egzonu za pomocą starterów opisanych gdzie indziej35 i przeprowadzanie reakcji klonowania i sekwencjonowania, jak opisano powyżej
[hasła pokrewne: suprasorb, hurtownia portfeli, chloramfenikol ]
[podobne: rodzaje rocka, immunochemia tsh, immunodiagnostyka ]